2.1  羊膜作为移植物的生物学特点  羊膜的生物学特点是羊膜制备处理及应用的基础。羊膜为胎膜的内层，呈0.02-0.05 mm厚的半透明薄膜，具有一定的韧性，无血管、神经和淋巴管。羊膜由上皮细胞层(单层表皮细胞组成)、基底膜、致密层、纤维母细胞层(间充质细胞)和海绵层组成。在羊膜的制备过程中常将纤维母细胞层和海绵层剥除，因此在临床应用的羊膜由上皮细胞层、基底膜和致密层组成，其中上皮细胞层富含由上皮细胞分泌的多种生长因子。 羊膜是一种天然高分子生物材料，含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分，表达多种生长因子及mRNA相关蛋白，可为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分，有利于细胞的生长繁殖，为羊膜在临床应用的主要结构基础。 羊膜内含有多种生长因子，包括碱性成纤维细胞生长因子、血小板生长因子、血管内皮生长因子、血管生长素、转化生长因子β2、凝血酶敏感蛋白1、组织金属蛋白酶抑制物1、组织金属蛋白酶抑制物2和肝细胞生长因子等，在促进组织修复中起重要作用，因此在制备过程中要尽可能保留生物活性成分。羊膜中生物活性因子主要通过减少炎症反应、降低瘢痕组织形成、促进正常软组织的结构修复和功能恢复来促进软组织损伤的修复。 羊膜中的生物活性因子主要存在于羊膜上皮细胞中，其中碱性成纤维细胞生长因子对角膜上皮细胞、角膜基质细胞、角膜内皮细胞的增殖、移行趋化有促进作用，术后对伤口愈合的影响持续时间较长，对眼表损伤修复有明显的促进作用。肝细胞生长因子具有刺激上皮细胞生长、增加细胞能动性的作用而有利于眼表上皮的修复。 Hao等[9]提取羊膜表皮细胞和间质细胞总RNAs，通过RT-PCR技术检测和DNA测序确认其中的抗血管形成和抗炎症蛋白的表达，结果表明人类羊膜上皮细胞和间质细胞表达白细胞介素1受体拮抗物、组织金属蛋白酶抑制物1、组织金属蛋白酶抑制物2、组织金属蛋白酶抑制物3、组织金属蛋白酶抑制物4、XVⅢ型胶原和白细胞介素10；而在所有上皮细胞样品和1/5间质细胞样品中表达凝血酶敏感蛋白1，进一步的免疫组织化学结果显示，组织金属蛋白酶抑制物族所有成员存在于上皮细胞、间质细胞及致密层中，部分解释了羊膜的抗炎抗血管形成机制。羊膜多能干细胞分泌多种细胞因子和生长因子，活化吞噬细胞而在伤口愈合和感染组织修复中起重要作用。Uberti等[10]研究了羊膜源性细胞因子溶液对巨噬细胞募集和对细菌等病原微生物活动的影响，结果显示在羊膜源性细胞因子溶液存在的情况下，巨噬细胞的迁移活动明显增强，巨噬细胞杀灭大肠杆菌的能力与羊膜源性细胞因子溶液的浓度呈正相关，表明羊膜可能通过其内细胞因子的作用促进细胞迁移和加强抗菌能力，促进伤口愈合。后续实验也证实，羊膜源性细胞因子溶液能促进角质细胞及纤维细胞的迁移、增殖和分化，促进上皮组织愈合[11] 。 收集羊膜来源的多能干细胞并对其内蛋白质进行定量和定性分析，发现羊膜来源的细胞生长因子溶液中含有与伤口愈合相关的生理水平的细胞因子，包含血小板生长因子、血管内皮生长因子、血管生长素、转化生长因子β2、组织金属蛋白酶抑制物1和组织金属蛋白酶抑制物2，这些生理水平的细胞因子在急性和慢性伤口愈合中起积极作用[12] 。Franz等[13]研究了羊膜来源的细胞生长因子溶液对急性和慢性伤口模型愈合的影响，急性模型采用SD大鼠进行剖腹切口，羊膜来源的细胞生长因子溶液预处理筋膜较PBS预处理能增加剖腹术的断裂强度，促进急慢性伤口的愈合。 2.2  羊膜的免疫学    一般认为羊膜不含HLA-Ⅱ类抗原，免疫原性极低，同种异体移植时排斥反应较小。羊膜的生物学特征，特别是免疫学特性是它能够成为临床理想移植材料的基础。但也有报道认为羊膜含有少量的HLA-Ⅱ类抗原，具有一定的免疫原性。虽然近年来冻干羊膜和新鲜羊膜移植临床研究并未见明显的免疫排斥现象，但缺乏体内免疫反应分析的相关研究。 华萍等[14]通过流式细胞仪分析外周血CD3+CD25+和CD3+CD71+表达水平，免疫组织化学法定量监测组织切片中CD3+  、CD4+ 、CD8+  、MHC-Ⅱ+表达水平，评价冻干羊膜、新鲜羊膜、绒毛膜和单纯手术组植入后的免疫反应，结果显示羊膜移植后早期，冻干羊膜组、新鲜羊膜组和单纯手术组小鼠外周血CD3+ CD25+ 和CD3+CD71+ 表达水平略有增高(P > 0.05)，但短期内自行回落；绒毛膜组外周血CD3+ CD25+和CD3+CD71+表达水平明显高于其余各组(P < 0.05)。单纯手术组、冻干羊膜组、新鲜羊膜组移植区组织CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 、MHC-Ⅱ+表达水平，在4个取样时间检测结果差异均无显著性意义(P > 0.05)；但绒毛膜移植组CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 、MH C-Ⅱ+ 表达水平明显升高，并显著高于其他各组(P < 0.05)。表明冻干羊膜和新鲜羊膜在体内移植后均表现出极低的免疫原性，不会引起由T细胞介导的特异性排斥反应，具有良好的组织相容性。对比研究新鲜羊膜和保存羊膜移植后的免疫反应，新鲜羊膜与保存羊膜在体内表现出几乎无差别的低免疫原性，不会引起由T细胞介导的特异性排斥反应，可视为免疫赦免组织应用[15] 。 张琪等[15]对比研究了新鲜羊膜和保存羊膜移植后的免疫反应，客观评价了羊膜移植的免疫安全性。实验建立BALB/c小鼠皮下埋植实验模型，按不同的埋植物分为单层新鲜羊膜组、双层新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组、绒毛膜组(阳性对照)和单纯手术组(阴性对照)；各组又随机分为5个亚组，分别对应术后1，2，4，8，12周共5个时点。大体观察小鼠的一般情况，流式细胞仪检测外周血CD3+CD25+和CD3+CD71+的表达，免疫组织化学法定量组织切片中CD3+ 、CD4+ 、CD8+的表达。结果显示：术后早期，单层新鲜羊膜组和双层新鲜羊膜组的小鼠外周血CD3+CD25+及CD3+CD71+表达略高于甘油保存羊膜组(P < 0.05)但短期内皆可自行回落。各羊膜组移植区组织CD3+ 、CD4+ 、CD8+的表达在术后1-12周均无显著差异(P < 0.05)。各羊膜组的免疫细胞表达均以非特异性为主，显著弱于绒毛膜组(P < 0.01)。结果说明新鲜羊膜与保存羊膜在体内表现出几乎无差别的低免疫原性，不会引起由T细胞介导的特异性排斥反应，可视为免疫赦免组织应用。 张琪等[16]还通过小鼠皮下植入模型对比新鲜与保存人羊膜异种移植后的免疫反应、组织改变及转归，结果显示，甘油保存羊膜、新鲜羊膜、双层新鲜羊膜移植区MHC-Ⅱ 表达及炎症细胞计数均明显小于阳性对照组(绒毛膜组)，均具有良好的免疫相容性及组织相容性，而含活细胞新鲜羊膜有更佳的修复重建效果。 2.3  羊膜的保存制备方法 羊膜的保存制备方法："

新鲜羊膜：早期常用甘油浸泡羊膜，置于4 ℃保存，该方法简单易行，但临床应用时需进行清洗去掉甘油，不能长期保存。国外应用较多的是将羊膜浸泡于Hank’s或DMEM平衡盐/甘油溶液，置于深低温长期保存，但运输不方便。同时存在交叉感染的风险，其在临床的应用受到限制。通常新鲜羊膜保存方式有以下几种：①纯甘油4 ℃保存。②体积分数50%的甘油-80 ℃保存。③乙醇4 ℃保存。均需低温或深低温保存，有研究表明，体积分数50%甘油溶液深低温保存不宜超过6个月，纯甘油4 ℃保存不宜超过3个月。很多学者认为新鲜羊膜中含有较多的生物活性分子，如多种生长因子、神经营养因子、基质金属蛋白酶抑制剂及凋亡抑制因子等，可促进受体上皮细胞移行黏附、增殖分化，阻止受体基质细胞凋亡，促进受体残存神经末梢的修复，可有效抑制角膜内急性炎症反应，抑制自由基的生成和增强超氧化物歧化酶的活力，减轻自由基对角膜组织的损伤。 深低温保存羊膜可以更好地避免术后免疫排斥反应。随着对羊膜基础研究的不断深入和对临床效果的不倦追求，新鲜羊膜与保存羊膜孰优孰劣成为争论热点。理论上，新鲜羊膜比保存羊膜有更强的生物活性，但也可检测出HLA-Ⅱ抗原，有使受体排斥的潜在可能。 新鲜羊膜中的生物活性物质浓度或种类较保存羊膜明显丰富，在促进上皮细胞的增殖分化、阻止基质细胞凋亡、促进神经末梢再生、抑制炎症和新生血管化，以及维持干细胞特性等方面都起着积极作用。保存羊膜或新鲜羊膜均不会引起明显的急性排斥反应，均为免疫安全性可靠的移植材料。 冷冻干燥羊膜：冷冻干燥羊膜是将羊膜在冷冻状态下去除水分，通常至含水量小于5%，冷冻干燥法能最大限度地降低处理方法对羊膜结构和活性的影响，保持正常羊膜结构及生物学活性。由于降低了含水量，抑制了酶的活性，减轻了酶对组织的降解，便于室温长期保存。华萍等[17]比较了Hank’s平衡盐/甘油溶液深低温(-80 ℃) 保存、纯甘油4 ℃保存、冷冻干燥常温保存法对羊膜生物学性能的影响，结果显示：与新鲜羊膜相比，保存羊膜在胶原酶Ⅳ溶液中降解速度均有所加快，其中纯甘油4 ℃保存羊膜降解速度最快，冷冻干燥保存羊膜降解速度最慢；冷冻干燥保存羊膜中被检测的8 种细胞因子残存量均超过40%；Hank’ s平衡盐/甘油溶液深低温保存和纯甘油4 ℃保存羊膜中8 种细胞因子残存量均低于20%，明显低于冷冻干燥保存羊膜细胞因子存留量。3种方法中以冷冻干燥常温法保存羊膜效果最好，纯甘油  4 ℃保存方法效果最差。冷冻干燥常温羊膜保存时限以不超过1年、Hank’s 平衡盐/甘油溶液深低温保存不超过6个月、纯甘油4 ℃保存不超过3个月为宜。经加速老化实验证明，冷冻干燥及辐照灭菌后保存的羊膜，常温下有效期可达2年，指出冷冻干燥羊膜是最便于临床应用的一种保存方式。通过对兔角膜碱烧伤修复作用的研究也证明了经辐照灭菌的冷冻干燥羊膜可减轻角膜炎性反应，促进角膜上皮修复，减少角膜新生血管形成[18] 。 但也有研究证实，冷冻干燥对羊膜中生长因子有一定的影响。有研究证实冻干羊膜中的肝细胞生长因子含量显著低于新鲜羊膜[19] ；但碱性成纤维细胞生长因子无显著性差异，提示冷冻干燥过程对羊膜生物活性因子有不同程度的负面影响，而肝细胞生长因子较碱性成纤维细胞生长因子更容易受到破坏。因此，冷冻干燥是一种较好保存羊膜的方法，工艺过程中应尽可能保持上皮细胞完整性及减少对生物活性因子的负面影响。 去细胞羊膜：细胞成分为抗原的主要载体，去除细胞成分能有效降低组织的抗原性。去细胞的方法有酶-化学法、机械法以及二者的结合。羊膜脱细胞基质不含羊膜上皮细胞，保留了羊膜基底膜与致密层，它的主要成分是Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型胶原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白，是一种天然的细胞外基质，是良好的组织工程生物载体材料。雷宁静等[20]分别采用TritonX-100预处理和甘油预处理，再经胰蛋白酶、EDTA 酶消化，制备羊膜脱细胞基质。经苏木精-伊红染色和扫描电镜观察两种方法制备的羊膜脱细胞基质均为白色、半透明膜状物，无细胞及其他组织残留，但Triton组羊膜脱细胞基质结构均匀平整，制备时间短。接种的人脐带间质干细胞在两种羊膜脱细胞基质表面黏附、增殖状况均良好，Triton 组细胞增殖状况总体优于甘油组，认为TritonX-100预处理并酶消化法是制备羊膜脱细胞基质较好的方法。 目前常用的羊膜脱细胞处理方法是胰酶酶解及物理方法，膜制备过程中可能会产生二次污染，并且过度酶解会破坏羊膜基质的蛋白结构及韧性，器械处理也可能会对羊膜造成损伤，这些不足降低了羊膜脱细胞基质作为天然细胞外基质的优越性。 2.4  羊膜的改性  近年来，许多学者通过生物工程技术对羊膜进行生物学改良，改变羊膜结构及成分，在保持羊膜基本生理特性的同时赋予其更多生物学功能，如生物复合型羊膜、药物羊膜以及生物复合型药学羊膜等。 通过复合及交联加强羊膜的生物力学性能。柯宁等[21]将羊膜和纤维蛋白胶黏合制备成胶联双层羊膜，提高了羊膜的生物力学强度，柔韧性和可塑性优于单层羊膜和双层羊膜，交联羊膜既能克服单层羊膜移植手术存在的不足，比如羊膜较薄，术中和术后易破裂，羊膜不易固定，术中操作较困难等，又能避免双层羊膜的层间积液、积气、缝线反应等并发症。 通过与药物及生长因子复合赋予羊膜更多性能。病毒性角膜炎居角膜病致盲原因的首位，常规的抗病毒治疗效果差，容易发展成角膜溃疡或角膜穿孔，为解决治疗中频繁给药、患者的依从性差且在眼深部组织难以获得有效的药物浓度等问题，有学者将更昔洛韦与纤维蛋白胶混合后再与羊膜黏合，制成一种更昔洛韦-纤维蛋白胶-羊膜复合物，在体外及体内条件下，更昔洛韦-纤维蛋白胶-羊膜复合物均具有良好的缓释特性[22] 。体外释放实验结果显示，在体外条件下更昔洛韦早期释放相对较快，之后逐渐减慢，释放可持续120 h以上。动物实验表明，更昔洛韦-纤维蛋白胶-羊膜复合物能够持续向眼表释放更昔洛韦，含一定量更昔洛韦的更昔洛韦-纤维蛋白胶-羊膜复合物可发挥一般眼液的作用并优于更昔洛韦眼液。Resch等[23]将单层羊膜作为氧氟沙星缓释载体，根据浸泡时间的长短，证明能达到7 d的缓释效果，特别适用于感染性角膜炎的治疗。郭华等[24]将有孔牛羊膜联合运用重组牛碱性成纤维细胞生长因子覆盖Ⅱ度烧伤创面，结果显示其能明显缩短创面愈合时间，减少换药次数和减轻疼痛。周文君等[25]将纤维蛋白胶交联羊膜与表皮生长因子/壳聚糖纳米粒复合，制备出无需缝合、生物力学性能好，具有好良好缓释性能的羊膜复合材料。 2.5  羊膜的灭菌  为杜绝疾病传播和便于保存，灭菌是羊膜处理的常用手段之一，常用的灭菌方法有抗生素浸泡(青霉素、庆大霉素和两性霉素B)、过氧乙酸/乙醇混合液灭菌法和辐照灭菌。 抗生素浸泡不能杀灭芽孢、病毒、原虫等致病菌，仅在早期或没有灭菌条件下用于羊膜的制备，起到延长保存时间的作用。过氧乙酸/乙醇混合液灭菌能杀灭一切微生物，常用于软组织的灭菌，在欧洲特别是德国的组织库应用最多。杨雨昆等[26]分别以抗生素、过氧乙酸/乙醇混合液、γ射线、碘伏灭菌羊膜，通过苏木精-伊红染色观察羊膜上皮细胞形态，免疫荧光和RT-PCR检测羊膜上皮细胞肝细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制物1和mRNA的表达，评价不同灭菌方法对角膜上皮细胞活性的影响，结果显示经过氧乙酸/乙醇混合液和抗菌药处理的羊膜上皮细胞形态完好，而经辐照处理对细胞的形态损害较大。经灭菌处理后，羊膜细胞的肝细胞生长因子和组织金属蛋白酶抑制物1蛋白表达均有所下降；实验中其表达量由高到低依次为过氧乙酸/乙醇混合液组、抗菌药组、碘伏组和γ射线组；肝细胞生长因子和组织金属蛋白酶抑制物1的mRNA表达也有下降，其中γ射线处理组下降趋势更明显，其余3个处理组间差异无显著性意义。认为过氧乙酸/乙醇混合液灭菌对羊膜的损伤最小。辐照是同种组织灭菌的常规方法，也常用于羊膜的灭菌，具有穿透性好、操作方便、无残留等优点，但一些研究证实其易对组织结构产生一定的影响，特别是破坏羊膜的上皮细胞，经辐照灭菌后结缔组织易分散成明显可见的纤维束[27-28] 。 过氧乙酸/乙醇用于羊膜灭菌具有一定的应用前景，与其他方法比较，需注意过氧乙酸须避光保存，使用时需临时配置，此外其在羊膜内残留量的控制以及其残留对羊膜实际应用效果的影响仍需进一步研究。 "